EN

Bio-techne|化學發光法:不是所有的 ELISA 都要測 OD 值喲

大家好,我是小菜雞張三,萬萬沒想到師兄讓我寄幾獨立做 ELISA 了。這個我懂,平時跟着師兄勤學苦練,拍板加樣我是有模有樣。

待我左手一個 OD450 nm,右手一個 540,納尼?化學發光法 ELISA 說明書上怎麼沒有 OD 值的要求啊?「少年郎,不是所有的 ELISA 都要測 OD 值喲。」暗中觀察已久的師兄得意揚揚地飄過。

下面是小博士上課時間

什麼是化學發光法 ELISA?

酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。首先將酶直接標記在抗原或抗體上,再經過抗原與抗體結合形成抗原抗體免疫複合物。通過不同底物與酶反應後產生的特定產物的特性,達到定量亚美app下载地址特定分子的目的。根據底物及相應產物的不同,ELISA 可分爲比色法(Colorimetric)與化學發光法(Chemiluminescent)兩類。

化學發光法酶聯免疫分析系統(Chemiluminescent ELISA)是在免疫反應結束後,加入酶的發光底物,產生處於激發態的中間體。之後中間體會發射光子釋放能量以回到穩定的基態,此發光強度可由光度計(Luminometer)進行亚美app下载地址,並利用標準曲線計算出被測物的含量。相比於比色法,化學發光法具有更高的靈敏度和更寬的亚美app下载地址範圍。

常見的化學發光組合是魯米諾(3-aminophthal hydrazide, Luminol)底物與辣根過氧化物酶反應。魯米諾於 1928 年首次被合成爲化學發光底物,該底物的發光反應需要苛刻的條件,發光暗淡且持續時間短。

之後研究人員發現,加入增強劑的增強型魯米諾反應(圖 1)能夠長時間產生明亮且穩定的發光效果,從而使得其廣泛應用於免疫分析,目前 R&D Systems® 的 QuantiGlo® 系列及 Novus Biologicals® 的 Chemiluminescent ELISA 均採用此原理。

圖 1:增強 luminol/peroxide 底物用於化學發光亚美app下载地址

QuantiGlo® ELISA Kit 的基本检测步骤

第一步:向包被有捕獲抗體的微孔板中加入樣品或標準品,孵育使分析物與包被的抗體結合,將未結合的其他分子清洗掉。

第二步:加入 HRP 偶聯的抗體(亚美app下载地址抗體)並與一抗捕獲的分析物結合。未結合的亚美app下载地址抗體被沖洗掉。

第三步:加入增強的魯米諾底物,使之與 HRP 反應發光,發光強度與樣品中存在的分析物數量成正比。利用微孔板光度計測量發光強度。

QuantiGlo® 试剂盒检测参数设置及应用举例

如 QuantiGlo® 試劑盒說明書所列,光度計設定可以使用以下參數或同等參數:1.0 分鐘滯後時間、亚美app下载地址時間 0.5 秒/孔、求和模式、自動增益或同等。

需要注意的是:

相對光單位(Relative light units,RLUs)數值由不同光度計亚美app下载地址可能不同,需要按照儀器製造商的建議調整設置。

相對光單位的數值可能在 15 分鐘的閱讀窗口期間內發生變化,由於需要參考標準曲線數值換算,所以這並不會影響結果。

 

應用舉例 1:Human VEGF QuantiGlo ELISA Kit(貨號 QVE00B)

使用 MOLECULAR DEVICE 品牌的 SpectraMax® L 微孔板化學發光酶標儀進行亚美app下载地址(SpectraMax® M5/M5e 和 FlexStation® 3 多功能酶標儀的化學發光亚美app下载地址模式也適用)。數據的收集和計算推薦由 SoftMax® Pro 軟件完成,其預設的模板極大地簡化了相應流程。

實驗步驟及儀器參數設置:

1. 每孔加入 150μL 实验稀释液 RD1-8;

2. 在微孔板中按 3 復孔形式加入 50μL 標準品或空白對照(Calibrator 稀釋液)。室溫輕度振盪(推薦 500 ± 50 rpm)微孔板 2 小时;

3. 孵育結束後使用排槍吸乾孔內反應液,並用 400μL 洗滌液清洗 4 遍。最後吸乾剩餘洗滌液並在乾淨的吸水紙上拍幹;

4. 每孔加入 200μL VEGF 複合物,貼上新的粘合帶。室溫輕度振盪 (推薦 500± 50 rpm) 微孔板 3 小时;

5. 按照步驟 3 進行清洗步驟;

6. 每孔加入 100μL Glo 工作液,室溫避光孵育 5 至 20 分鐘;

7. 用 SpectraMax® L 微孔板化學發光酶標儀測定 RLU 值。相關參數如下:1 秒亚美app下载地址時間,PMT 自動和 470 nm 目標校準波長。

結果:顯示由 SpectraMax® L 微孔板化學發光酶標儀按照上述的參數所得的 VEGF 標準曲線, 其動態範圍超過 4 個數量級,計算所得的亚美app下载地址限,也就是空白對照信號標準差 3 倍值的相應量爲 1.5 pg/mL,與該試劑盒平均亚美app下载地址下限爲 3.3 pg/mL 相符。

圖 2,20,000-1.3 pg/mL 的標準品亚美app下载地址曲線圖。實驗由 SpectraMax® L 微孔板化學發光酶標儀按照 1 秒亚美app下载地址時間,PMT 自動和 470 nm 目標校準波長的參數進行讀取。標準曲線由 SoftMax® Pro 软件绘制。

應用舉例 2:Human IL-6 QuantiGlo ELISA Kit(貨號 Q6000) 

使用 DYNEX TECHNOLOGIES 品牌的 MLX™微量滴定光度計測量光的強度,繪製標準曲線,並分析結果。由於底物發光持續時間長,所以閱讀窗口期可以是加入底物後的 20~40 分鐘之間。實驗步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作。

儀器參數設定:

① 起始模式(Start Mode):1 分鐘滯後時間

② 振盪及溫度設定:關閉(Off)

③ 亚美app下载地址選項:

  • 自動讀取 (Auto Gain)
  • 求和模式 (Sum all Readings)
  • 亚美app下载地址時間 1 秒/孔

 

軟件操作:

① 只含有校準稀釋液(Calibrator Diluent)的標準品零值孔被定義爲空白孔(Blank):
含有其他不同濃度標準品的孔被定義爲 S1-S5 孔。
含有陽性對照(Control)的孔根據對應標籤使用「用戶可定義的類型(User Definable Types)」定義爲 LL、L、M、H。
含有樣本的孔需定義爲測試品(Tests)。

② 在空白模式窗口中,選擇平均(Average)。將所有空白孔(標準品零值孔)取平均值,其他孔值將統一減去這個平均值。

③ 在曲線擬合(curve fit)窗口中,輸入 S1-S5 的 IL-6 標準品濃度,並在相對光(Relative Light)窗口使用 log/log Cubic Spline 模式擬合併繪製曲線。

④ 數據矩陣(Data Matrix)及擬合曲線圖將呈現在測試報告(Test Report)中。

結果:

——「喔,我明白了,師兄選這個盒子是考慮到實驗組間樣本中目標分析物的含量差異大,過多的稀釋操作一方面費時費力,另一方面容易造成誤差對吧,師兄果然厲害!」

——「其实,主要还是因为我懒……」

 

以上文字和圖片來源於Bio-techne

 

 

 

附件: